活细胞的荧光成像用于观察动态细胞过程并随时间追踪细胞生物分子和结构。活细胞荧光成像用于观察动态细胞过程并随时间跟踪细胞生物分子和结构。 活细胞荧光成像能够分析天然状态的细胞，从而保留细胞功能，能够研究细胞骨架重排、细胞凋亡、细胞迁移、内吞作用、吞噬作用和细胞器动力学等细胞过程，是药物发现、癌症、发育生物学、环境科学和其他医学领域研究的利器。
使用如下指南设计活细胞成像实验、选择试剂，轻松拿到可靠的数据。
如何选择成像试剂
活细胞成像试剂包括靶向性荧光蛋白和膜渗透荧光染料。许多活细胞成像试剂可用于数小时或数天的延时成像，也有一些试剂适合终点检测、细胞染色后立即成像和分析。 染色浓度、孵育时间、成像时间和间隔/频率应根据经验确定，以尽量减少细胞毒性并保留细胞功能。
下面的活细胞成像指南中的试剂与自动化高内涵和基于培养箱的荧光成像系统兼容，例如：配备 EVOS Onstage 培养箱的 Thermo Fisher Scientific 的 EVOS M7000 和 M5000 细胞成像系统、CellInsight HCS 高内涵平台、PerkinElmer 的 MuviCyte™ 活细胞成像系统*、Leica 的 Thunder 和 Mica* 以及 Sartorius 的 Incucyte® 活细胞分析系统™*。
如何选择活细胞成像试剂表格
EVOS DAPI 光立方EVOS GFP 光立方 激发波长：470/22 nm； 发射波长：510/42 nmEVOS RFP 光立方激发波长：531/40 nm；发射波长：593/40 nmEVOS Red 光立方激发波长：585/29 nm；发射波长：624/40 nmEVOS Cy5 光立方激发波长：628/40 nm；发射波长：693/40 nm活细胞成像时长Incucyte 绿色滤光片Incucyte 橙色滤光片Incucyte 红色滤光片Incucyte NIR 滤光片抗体内化 pHrodo Green iFL 抗体标记试剂 pHrodo Red iFL 抗体标记试剂 pHrodo Deep Red 抗体标记试剂长期（几小时到过夜）细胞凋亡 CellEvent 半胱天冬酶-3/7 绿色荧光检测试剂 CellEvent 半胱天冬酶-3/7 红色荧光检测试剂 长期（过夜到48~72h）细胞自噬 Premo 自噬传感器（p62 和 LC3B）GFPPremo 自噬传感器（p62 和 LC3B）RFP 长期（过夜到 48 小时）细胞示踪CellTracker 染料短期到长期（72小时/~3或更多细胞代数）细胞骨架（微丝） CellMask Green 肌动蛋白示踪染料CellMask Orange 肌动蛋白示踪染料 CellMask Deep Red 肌动蛋白示踪染料短时间至长时间（24 小时以上）细胞骨架（微管蛋白） Tubulin Tracker Green Tubulin Tracker Deep Red短期内含体/内吞 pHrodo 和 Alexa Fluor 葡聚糖短期到长期（几分钟到几小时；某些应用需要过夜或更长）配体内化 Alexa Fluor、BODIPY 和 pHrodo LDL 偶联物短期到长期（几分钟到过夜或更长时间）Alexa Fluor 和 pHrodo EGF 和转铁蛋白偶联物内质网 ER-Tracker Green ER-Tracker Red 终点检测缺氧 Image-iT Green 缺氧检测试剂 终点检测 钙流 Fluo-4 钙成像试剂盒Rhod-3 钙成像试剂盒 短期（几分钟到几小时）溶酶体LysoTracker 和 LysoSensor 染料短期（几分钟到几小时）细胞膜（质膜和内膜） Vybrant 细胞标记试剂长期线粒体结构 MitoTracker 染料长期线粒体功能 TMRM 短期（几分钟到几小时）TMRE细胞核HCS NuclearMask Blue 染料SYTO 9 Green 荧光核酸染料 HCS NuclearMask Red 染料HCS NuclearMask Deep Red 染料终点检测Hoechst 33342 NucRed Live 647 ReadyProbes 试剂NucBlue Live ReadyProbes 试剂 DRAQ5 荧光探针试剂细胞质膜 CellMask Green 细胞膜染料CellMask Orange 细胞膜染料 CellMask Deep Red 细胞膜染料短期（10~90 分钟，可以成像更长时间，但会内化）活性氧 CellROX Green 试剂CellROX Orange 试剂 CellROX Deep Red 试剂长期（24小时） H2DCFDA 染料 短期（~2 小时）ThiolTracker VioletMitoSOX Green 超氧化物指示剂 终点检测吞噬作用 pHrodo Green BioParticles 偶联物pHrodo Red BioParticles 偶联物 pHrodo Deep Red BioParticles 偶联物短期到长期（几分钟到几小时或更长时间） 存活率钙黄绿素蓝，AM钙黄绿素，AM，细胞可透过性染料 短时间（几分钟至几小时） SYTOX Green 核酸染料SYTOX Orange 核酸染料 SYTOX Deep Red 核酸染料 LIVE/DEAD 活力/细胞毒性测定试剂盒（绿色/深红色） LIVE/DEAD 活力/细胞毒性测定试剂盒（绿色/深红色）基于荧光蛋白的细胞结构试剂 CellLight GFP，BacMam 2.0CellLight RFP，BacMam 2.0 长期（过夜到几天/2-3代）活细胞成像5步法查看更多Step 1实验设计Step 2细胞培养Step 3细胞标记Step 4信号优化Step 5成像观察
步骤 1：实验设计
在设计活细胞成像实验方案时，请参考辅助小工具和资源仔细考虑每一个步骤。
活细胞成像的优点可以观察动态细胞过程的发生能使用多色检测同时对几个细胞过程和细胞功能进行研究和成像可研究细胞在其原生环境中的结构，从而获得更接近体内环境的更真实结果实现随时间追踪细胞生物分子和结构可观察细胞之间的相互作用让细胞酶和其他胞质生物分子保留在细胞中活细胞成像需考虑的事项必须有一种特定的方法来以最小的毒性标记您的研究靶标-无论是分子、细胞功能还是细胞状态活细胞通常对于某些大的检测分子是不可透过的，例如抗体移动的目标会更难保持聚焦使用的某些技术是否可能对活细胞有害细胞必须保持其自然生理状态
步骤 2：细胞培养
在最佳条件下维持或培养细胞。
在各种实验操作、标记检测和成像观察过程中一直保持细胞存活和健康并非易事。对于延时成像和细胞长时间暴露于周围环境条件下的实验，培养基的选择尤为重要。若要获得可靠的活细胞成像实验结果，非常重要的一点是：细胞必须健康并保持存在尽可能接近生理温度、pH、氧气水平及其他条件的环境中。
了解更多细胞培养
产品特点这些培养基和洗涤缓冲液专门用于活细胞成像和检测。在实验中使用它们可以帮助您提高图像清晰度、减少背景荧光并提高细胞活力。
经证实，采用 Nunclon Delta 表面处理过的 Thermo Scientific Nunc 细胞培养皿，搭配 Gibco 培养基，可以保证多种细胞系一致的细胞生长情况。这种组合经证明是可靠的，可以培养出令科学家满意的健康细胞。Gibco 细胞外基质、细胞支架和蛋白质可提供类似体内的形态和生理学环境，以形成更真实的细胞生物学及更好的细胞间作用环境。Invitrogen Countess III FL 自动细胞计数仪是一种经济实惠的自动化工具，可用于快速、客观地检查细胞的健康状况。它具有可重复使用或一次性的载玻片选项。小贴士通过使用专门为活细胞成像和检测而开发的培养基和洗涤缓冲液，您可以提高图像清晰度、减少背景荧光并提高细胞活力。查阅产品选择指南
步骤 3：细胞标记
用特异性染料和荧光标记试剂靶向标记细胞结构、细胞功能和目标蛋白质。
应选用合适的荧光染料（特异性靶向的荧光蛋白或小的膜通透性试剂）来检测目标细胞的结构或过程。可以使用其他荧光染料一起同时检测多个细胞结构和过程，但需要使用 SpectraViewer 荧光光谱查看器检查激发光谱和发射光谱以确保不同荧光染料之间符合最小光谱重叠。切记尽量避免使用过多的荧光标记，因为过多的荧光标记会导致：
非特异性染色，背景信号增强出现生理伪影和结构扰动细胞毒性光谱重叠请注意：活细胞结构标记试剂——是为了帮助鉴定细胞成份活细胞功能检测试剂——是为了帮助识别细胞功能和过程产品特点Invitrogen CellLight 试剂是经研究证实最易于标记活细胞中特定结构的一类试剂。使用 Invitrogen BacMam 技术转导系统导入靶向特异性的荧光蛋白；不需要分子克隆。您只需要将试剂加入到细胞中，过夜孵育，第二天早上即可进行成像观察。Invitrogen CellTracker 试剂包含一系列用于标记哺乳动物细胞以查看细胞形态或位置变化的多种试剂。这些荧光染料没有毒性，能够自由地穿过细胞膜进入细胞，并在胞内转化为不具有细胞通透性的反应产物。将细胞与 CellTracker 试剂一起孵育 30 分钟将提供至少 72 小时的荧光信号（通常为三到六代）。Invitrogen pHrodo 指示剂是一种酸性指示剂荧光染料，随其周围环境中 pH 值的降低，荧光信号显著增强。当结合到葡聚糖、蛋白质或其他颗粒时，pHrodo 染料可用作活细胞中内吞和吞噬内化和溶酶体小泡的高度特异性指示剂，比其他荧光染料（如荧光素和四甲基罗丹明等）的结合物更特异且背景更低。小贴士如果需要长时间曝光，请尽量选择使用更长波长的荧光试剂。这种试剂需要较低的激发功率，具有更低的光毒性，可以提供更健康的细胞状态。必须针对特定的测定读值、光谱兼容性和信噪比对染色进行优化。要去除标记溶液并使用新鲜配制的培养基冲洗，可减少背景荧光。
步骤 4：信号优化
尽可能降低背景并保持荧光信号的光稳定性。
通过使用减少细胞外荧光并能增加荧光染料光稳定性的试剂，可以最大程度的优化信噪比。在专门设计用于维持细胞健康同时减少或消除活细胞成像实验中的背景荧光的培养基中成像非常重要（请参见表 1）。加入适用于活细胞的背景抑制剂也有助于减少细胞外背景荧光，并且不需要额外清洗步骤。可以将活细胞抗淬灭试剂用于样品，以减少荧光染料的光漂白，从而防止多次或长时间曝光导致信号丢失。
表 1.成像培养基比较。
试剂细胞清洗短时成像持续成像 4 小时长时成像Gibco PBS, pH 7.4 Gibco FluroBrite DMEM产品特点Invitrogen BackDrop 背景抑制剂适用于在蓝色、绿色或红色荧光通道中观察到高背景信号或弱目标荧光信号时的情况。Gibco PBS, pH 7.4适用于不需要长时间孵育的细胞的清洗或短时成像。Invitrogen 活细胞成像溶液是一种光学透明的溶液，适用于成像观察、染料标记和清洗步骤。它有助于保持细胞健康长达 4 小时。
用 Tubulin Tracker Green 染料和 Tubulin Tracker Deep Red 染料标记的活 HeLa 细胞。当探针留在染色溶液中（左）时，两种标记均显示出较高的细胞外背景。添加 BackDrop 背景抑制剂会大幅降低细胞外背景，同时不会影响细胞内标记（右），因此无需清洗方案，可用于活细胞中微管蛋白的高对比度成像。
相对于未处理样品，ProLong Live 试剂提供的总体信号保护是根据经处理和未处理样品达到 EC50 值的扫描次数计算的。加入 ProLong Live 试剂后，可使 Invitrogen CellLight 线粒体-RFP 试剂的捕获率增加 100%。
使用标准延时成像方案进行 120 次曝光后，采用 ProLong Live 试剂处理的样品比未处理的细胞亮度高 20% 以上，从而延长了数据采集时间。
小贴士如果不进行进一步培养，则可以使用背景抑制剂通过减少背景和增加对比度来优化荧光信号。对各种样品类型，使用抗淬灭剂都可提高荧光染料的光稳定性，并降低光毒性的影响。
步骤 5：成像观察
动态过程的活细胞成像需要长期观察
照明与检测为了使光毒性最小，推荐选择可以最大程度地控制光源的成像系统。尝试使用尽可能低的光强度、曝光时间、波长范围和激发能量来照亮激发细胞，同时维持低背景下的良好信号。使用能够以最低的荧光染料激发水平提供最高信号的光照。在某些情况下（特别是当您希望长时间成像时），建议使用较短的曝光时间或较低的放大倍数，牺牲分辨率来获得更健康的细胞。
较长时间的活细胞成像可能非常具有挑战性，因为观察目标可能会在实验过程中因移动而失焦。许多显微镜具有自动聚焦功能，可以帮助您保持更长的目标聚焦时间并减少焦点漂移。另外，将细胞培养在恒定温度并保持容器中溶液的体积恒定也有助于解决聚焦漂移问题。
环境控制许多细胞比较敏感，不能允许偏离它们的最佳温度、摩尔渗透压浓度、pH 和湿度。具体要求因您所关注的实验性问题而有所不同。例如，研究细胞生长和分裂的实验与涉及受体激活和钙积累的实验相比可能有不同的要求。一些强健的永生细胞系可以允许短时期的成像或监测，而无需任何环境控制。相反，对于长期成像和检测研究，永生细胞和原代细胞的良好结果通常需要严格控制环境参数。
点击图片放大在加入了 Invitrogen CellTracker Deep Red 染料的 HDFn 细胞培养物中的划痕实验。(A) 对照射区域重复照射 10 小时。该区域中的细胞呈现出光毒性迹象（细胞活力丧失，因细胞无法生长到划痕处）。(B) 对比未照明区域中的细胞发现，有活力的细胞可以生长至划痕上。
上面的细胞显示出由于过度曝光导致的细胞膜灾难性起泡。起泡是用于描述由毒性引起的膜扰动的术语。相比之下，下面的细胞相对更健康，并且没有显示出异常形态。
产品特点
Countess III FL 全自动细胞计数仪为避免用不健康细胞进行下一步实验的麻烦，当与多种荧光试剂结合使用以检测细胞活力、细胞凋亡、细胞毒性和转染效率时，可以先在Countess III FL 自动细胞计数仪上进行细胞健康的快速检查。可重复使用的载玻片选项可降低消耗成本。
带有 EVOS 台式培养室的 Invitrogen EVOS M5000 成像系统Invitrogen EVOS 台式培养室是专门为 Invitrogen EVOS 成像系统设计的一个环境控制设备，可以精确控制温度、湿度和三种气体调节，以便在生理和非生理条件下对活细胞进行延时成像。
带有 HCA 台式培养室的 CellInsight CX7 LZR 高内涵筛选平台用于 Thermo Scientific CellInsight HCA 平台的 Invitrogen HCA台式培养器可精确控制温度、湿度和 CO2 水平，这样就可以观察和测量生物活性及其随时间的变化。从长时成像研究中收集的数据是定量分析研究的基础，尤其是与 Thermo Scientific HCS Studio 软件结合使用以提高统计能力时更是如此。
小贴士对于短时成像实验，请使用足量成像培养基，以防止由于培养基蒸发而导致的渗透压和氧气变化。对样本聚焦时，请先从低放大倍数开始。这将使样品暴露于光的时间缩短至最低。避免在延时成像过程中对每张图像使用自动聚焦。自动聚焦可使照射样品的光能增加多达 10 倍。对于较长时间的成像或敏感细胞的成像，可以在成像设备上添加一个台式培养器 (OSI)，以实现对温度、湿度和 CO2 水平的准确控制。
Step 1 :
实验设计
步骤 1：实验设计
在设计活细胞成像实验方案时，请参考辅助小工具和资源仔细考虑每一个步骤。
活细胞成像的优点可以观察动态细胞过程的发生能使用多色检测同时对几个细胞过程和细胞功能进行研究和成像可研究细胞在其原生环境中的结构，从而获得更接近体内环境的更真实结果实现随时间追踪细胞生物分子和结构可观察细胞之间的相互作用让细胞酶和其他胞质生物分子保留在细胞中活细胞成像需考虑的事项必须有一种特定的方法来以最小的毒性标记您的研究靶标-无论是分子、细胞功能还是细胞状态活细胞通常对于某些大的检测分子是不可透过的，例如抗体移动的目标会更难保持聚焦使用的某些技术是否可能对活细胞有害细胞必须保持其自然生理状态
Step 2 :
细胞培养
步骤 2：细胞培养
在最佳条件下维持或培养细胞。
在各种实验操作、标记检测和成像观察过程中一直保持细胞存活和健康并非易事。对于延时成像和细胞长时间暴露于周围环境条件下的实验，培养基的选择尤为重要。若要获得可靠的活细胞成像实验结果，非常重要的一点是：细胞必须健康并保持存在尽可能接近生理温度、pH、氧气水平及其他条件的环境中。
了解更多细胞培养
产品特点这些培养基和洗涤缓冲液专门用于活细胞成像和检测。在实验中使用它们可以帮助您提高图像清晰度、减少背景荧光并提高细胞活力。
经证实，采用 Nunclon Delta 表面处理过的 Thermo Scientific Nunc 细胞培养皿，搭配 Gibco 培养基，可以保证多种细胞系一致的细胞生长情况。这种组合经证明是可靠的，可以培养出令科学家满意的健康细胞。Gibco 细胞外基质、细胞支架和蛋白质可提供类似体内的形态和生理学环境，以形成更真实的细胞生物学及更好的细胞间作用环境。Invitrogen Countess III FL 自动细胞计数仪是一种经济实惠的自动化工具，可用于快速、客观地检查细胞的健康状况。它具有可重复使用或一次性的载玻片选项。小贴士通过使用专门为活细胞成像和检测而开发的培养基和洗涤缓冲液，您可以提高图像清晰度、减少背景荧光并提高细胞活力。查阅产品选择指南
Step 3 :
细胞标记
步骤 3：细胞标记
用特异性染料和荧光标记试剂靶向标记细胞结构、细胞功能和目标蛋白质。
应选用合适的荧光染料（特异性靶向的荧光蛋白或小的膜通透性试剂）来检测目标细胞的结构或过程。可以使用其他荧光染料一起同时检测多个细胞结构和过程，但需要使用 SpectraViewer 荧光光谱查看器检查激发光谱和发射光谱以确保不同荧光染料之间符合最小光谱重叠。切记尽量避免使用过多的荧光标记，因为过多的荧光标记会导致：
非特异性染色，背景信号增强出现生理伪影和结构扰动细胞毒性光谱重叠请注意：活细胞结构标记试剂——是为了帮助鉴定细胞成份活细胞功能检测试剂——是为了帮助识别细胞功能和过程产品特点Invitrogen CellLight 试剂是经研究证实最易于标记活细胞中特定结构的一类试剂。使用 Invitrogen BacMam 技术转导系统导入靶向特异性的荧光蛋白；不需要分子克隆。您只需要将试剂加入到细胞中，过夜孵育，第二天早上即可进行成像观察。Invitrogen CellTracker 试剂包含一系列用于标记哺乳动物细胞以查看细胞形态或位置变化的多种试剂。这些荧光染料没有毒性，能够自由地穿过细胞膜进入细胞，并在胞内转化为不具有细胞通透性的反应产物。将细胞与 CellTracker 试剂一起孵育 30 分钟将提供至少 72 小时的荧光信号（通常为三到六代）。Invitrogen pHrodo 指示剂是一种酸性指示剂荧光染料，随其周围环境中 pH 值的降低，荧光信号显著增强。当结合到葡聚糖、蛋白质或其他颗粒时，pHrodo 染料可用作活细胞中内吞和吞噬内化和溶酶体小泡的高度特异性指示剂，比其他荧光染料（如荧光素和四甲基罗丹明等）的结合物更特异且背景更低。小贴士如果需要长时间曝光，请尽量选择使用更长波长的荧光试剂。这种试剂需要较低的激发功率，具有更低的光毒性，可以提供更健康的细胞状态。必须针对特定的测定读值、光谱兼容性和信噪比对染色进行优化。要去除标记溶液并使用新鲜配制的培养基冲洗，可减少背景荧光。
Step 4 :
信号优化
步骤 4：信号优化
尽可能降低背景并保持荧光信号的光稳定性。
通过使用减少细胞外荧光并能增加荧光染料光稳定性的试剂，可以最大程度的优化信噪比。在专门设计用于维持细胞健康同时减少或消除活细胞成像实验中的背景荧光的培养基中成像非常重要（请参见表 1）。加入适用于活细胞的背景抑制剂也有助于减少细胞外背景荧光，并且不需要额外清洗步骤。可以将活细胞抗淬灭试剂用于样品，以减少荧光染料的光漂白，从而防止多次或长时间曝光导致信号丢失。
表 1.成像培养基比较。
试剂细胞清洗短时成像持续成像 4 小时长时成像Gibco PBS, pH 7.4 Gibco FluroBrite DMEM产品特点Invitrogen BackDrop 背景抑制剂适用于在蓝色、绿色或红色荧光通道中观察到高背景信号或弱目标荧光信号时的情况。Gibco PBS, pH 7.4适用于不需要长时间孵育的细胞的清洗或短时成像。Invitrogen 活细胞成像溶液是一种光学透明的溶液，适用于成像观察、染料标记和清洗步骤。它有助于保持细胞健康长达 4 小时。
用 Tubulin Tracker Green 染料和 Tubulin Tracker Deep Red 染料标记的活 HeLa 细胞。当探针留在染色溶液中（左）时，两种标记均显示出较高的细胞外背景。添加 BackDrop 背景抑制剂会大幅降低细胞外背景，同时不会影响细胞内标记（右），因此无需清洗方案，可用于活细胞中微管蛋白的高对比度成像。
相对于未处理样品，ProLong Live 试剂提供的总体信号保护是根据经处理和未处理样品达到 EC50 值的扫描次数计算的。加入 ProLong Live 试剂后，可使 Invitrogen CellLight 线粒体-RFP 试剂的捕获率增加 100%。
使用标准延时成像方案进行 120 次曝光后，采用 ProLong Live 试剂处理的样品比未处理的细胞亮度高 20% 以上，从而延长了数据采集时间。
小贴士如果不进行进一步培养，则可以使用背景抑制剂通过减少背景和增加对比度来优化荧光信号。对各种样品类型，使用抗淬灭剂都可提高荧光染料的光稳定性，并降低光毒性的影响。
Step 5 :
成像观察
步骤 5：成像观察
动态过程的活细胞成像需要长期观察
照明与检测为了使光毒性最小，推荐选择可以最大程度地控制光源的成像系统。尝试使用尽可能低的光强度、曝光时间、波长范围和激发能量来照亮激发细胞，同时维持低背景下的良好信号。使用能够以最低的荧光染料激发水平提供最高信号的光照。在某些情况下（特别是当您希望长时间成像时），建议使用较短的曝光时间或较低的放大倍数，牺牲分辨率来获得更健康的细胞。
较长时间的活细胞成像可能非常具有挑战性，因为观察目标可能会在实验过程中因移动而失焦。许多显微镜具有自动聚焦功能，可以帮助您保持更长的目标聚焦时间并减少焦点漂移。另外，将细胞培养在恒定温度并保持容器中溶液的体积恒定也有助于解决聚焦漂移问题。
环境控制许多细胞比较敏感，不能允许偏离它们的最佳温度、摩尔渗透压浓度、pH 和湿度。具体要求因您所关注的实验性问题而有所不同。例如，研究细胞生长和分裂的实验与涉及受体激活和钙积累的实验相比可能有不同的要求。一些强健的永生细胞系可以允许短时期的成像或监测，而无需任何环境控制。相反，对于长期成像和检测研究，永生细胞和原代细胞的良好结果通常需要严格控制环境参数。
点击图片放大在加入了 Invitrogen CellTracker Deep Red 染料的 HDFn 细胞培养物中的划痕实验。(A) 对照射区域重复照射 10 小时。该区域中的细胞呈现出光毒性迹象（细胞活力丧失，因细胞无法生长到划痕处）。(B) 对比未照明区域中的细胞发现，有活力的细胞可以生长至划痕上。
上面的细胞显示出由于过度曝光导致的细胞膜灾难性起泡。起泡是用于描述由毒性引起的膜扰动的术语。相比之下，下面的细胞相对更健康，并且没有显示出异常形态。
产品特点
Countess III FL 全自动细胞计数仪为避免用不健康细胞进行下一步实验的麻烦，当与多种荧光试剂结合使用以检测细胞活力、细胞凋亡、细胞毒性和转染效率时，可以先在Countess III FL 自动细胞计数仪上进行细胞健康的快速检查。可重复使用的载玻片选项可降低消耗成本。
带有 EVOS 台式培养室的 Invitrogen EVOS M5000 成像系统Invitrogen EVOS 台式培养室是专门为 Invitrogen EVOS 成像系统设计的一个环境控制设备，可以精确控制温度、湿度和三种气体调节，以便在生理和非生理条件下对活细胞进行延时成像。
带有 HCA 台式培养室的 CellInsight CX7 LZR 高内涵筛选平台用于 Thermo Scientific CellInsight HCA 平台的 Invitrogen HCA台式培养器可精确控制温度、湿度和 CO2 水平，这样就可以观察和测量生物活性及其随时间的变化。从长时成像研究中收集的数据是定量分析研究的基础，尤其是与 Thermo Scientific HCS Studio 软件结合使用以提高统计能力时更是如此。
小贴士对于短时成像实验，请使用足量成像培养基，以防止由于培养基蒸发而导致的渗透压和氧气变化。对样本聚焦时，请先从低放大倍数开始。这将使样品暴露于光的时间缩短至最低。避免在延时成像过程中对每张图像使用自动聚焦。自动聚焦可使照射样品的光能增加多达 10 倍。对于较长时间的成像或敏感细胞的成像，可以在成像设备上添加一个台式培养器 (OSI)，以实现对温度、湿度和 CO2 水平的准确控制。
应用案例
示例一：活细胞成像实验中的细胞凋亡示例二：活细胞成像实验中的线粒体活性
示例：活细胞成像实验中的细胞凋亡
细胞凋亡是一种严格控制的程序性细胞死亡过程，用于去除多余的、受损的和不需要的细胞或组织。 细胞凋亡可以通过 caspase 激活、DNA 片段化、线粒体活性破坏和质膜变化来检测。 CellEvent Caspase 3/7 试剂是荧光型 caspase 底物，可检测 caspase 激活以测定活细胞的细胞凋亡。 这些试剂不需要洗涤步骤，可用于 48 小时或更长时间的实时和延时活细胞凋亡成像。
图 1.使用 CellEvent 半胱天冬酶-3/7 绿色荧光测定试剂（货 CellEvent Caspase-3/7 Green 试剂（货号 C10432）检测细胞凋亡的工作流程。将待测细胞铺到孔板内，然后加入稀释的 CellEvent Caspase-3/7 Green 检测试剂。 CellEvent Caspase 3/7 染料可直接在完全培养基中使用，无需清洗。 最快可在试剂加入30分钟后开始检测荧光，最长可达 72 小时。
下载CellEvent Caspase-3/7 实验方案
图 2.使用 CellEvent Caspase 3/7 Green 染色检测细胞凋亡的示例。HuVEC 细胞用 CellEvent Caspase 3/7 Green Assay（货号 C10432）染色处理，并在处理后 0、24、48 和 72 小时使用 Incucyte® ZOOM 活细胞分析系统成像。 （图像来源：Sambi M, Samuel V, Qorri B, Haq S, Burov SV, Markvicheva E, Harless W, Szewczuk MR.A Triple Combination of Metformin, Acetylsalicylic Acid, and Oseltamivir Phosphate Impacts Tumour Spheroid Viability and Upends Chemoresistance in Triple-Negative Breast Cancer.Drug Des Devel Ther.2020;14:1995-2019 PMID: 32546966)
C10430,C10432
示例：活细胞成像实验中的线粒体活性
活细胞成像试剂包括用于识别细胞成分的细胞结构试剂和用于分析细胞功能和过程的细胞功能试剂。 例如，MitoTracker 染料在活细胞的活性线粒体中积累，并共价附着在线粒体上，以评估线粒体定位和丰度。 相比之下，TMRM 和 TMRE 是动态线粒体膜电位指示染料，它们会根据膜电位在线粒体内外流动。
图 3.监测活细胞中的活性线粒体。培养患者的成纤维细胞系，并用 MitoTracker Red （货号 M22426）、Image-iT DEAD Green 染料 （货号 I10291）、Hoechst（货号 R37165）进行活细胞染色， 并在 Incucyte® ZOOM 活细胞成像系统上检测和分析。（图像来源：Smith GA, Jansson J, Rocha EM, Osborn T, Hllett PJ, Isacson O. Fibroblast Biomarkers of Sporadic Parkinson's Disease and LRRK2 Kinase Inhibition.Mol Neurobiol.2016 Oct;53(8):5161-77.PMCID: PMC5012155.）用 MitoTracker Red 染色的细胞如图所示，线粒体活跃的细胞呈鲜红色，死亡细胞呈绿色，细胞核呈蓝色，并用 Incucyte® ZOOM 活细胞分析仪进行成像。
M7514,A66441,M22426,A66440,M7512,A66443
示例一：活细胞成像实验中的细胞凋亡
示例：活细胞成像实验中的细胞凋亡
细胞凋亡是一种严格控制的程序性细胞死亡过程，用于去除多余的、受损的和不需要的细胞或组织。 细胞凋亡可以通过 caspase 激活、DNA 片段化、线粒体活性破坏和质膜变化来检测。 CellEvent Caspase 3/7 试剂是荧光型 caspase 底物，可检测 caspase 激活以测定活细胞的细胞凋亡。 这些试剂不需要洗涤步骤，可用于 48 小时或更长时间的实时和延时活细胞凋亡成像。
图 1.使用 CellEvent 半胱天冬酶-3/7 绿色荧光测定试剂（货 CellEvent Caspase-3/7 Green 试剂（货号 C10432）检测细胞凋亡的工作流程。将待测细胞铺到孔板内，然后加入稀释的 CellEvent Caspase-3/7 Green 检测试剂。 CellEvent Caspase 3/7 染料可直接在完全培养基中使用，无需清洗。 最快可在试剂加入30分钟后开始检测荧光，最长可达 72 小时。
下载CellEvent Caspase-3/7 实验方案
图 2.使用 CellEvent Caspase 3/7 Green 染色检测细胞凋亡的示例。HuVEC 细胞用 CellEvent Caspase 3/7 Green Assay（货号 C10432）染色处理，并在处理后 0、24、48 和 72 小时使用 Incucyte® ZOOM 活细胞分析系统成像。 （图像来源：Sambi M, Samuel V, Qorri B, Haq S, Burov SV, Markvicheva E, Harless W, Szewczuk MR.A Triple Combination of Metformin, Acetylsalicylic Acid, and Oseltamivir Phosphate Impacts Tumour Spheroid Viability and Upends Chemoresistance in Triple-Negative Breast Cancer.Drug Des Devel Ther.2020;14:1995-2019 PMID: 32546966)
C10430,C10432
示例二：活细胞成像实验中的线粒体活性
示例：活细胞成像实验中的线粒体活性
活细胞成像试剂包括用于识别细胞成分的细胞结构试剂和用于分析细胞功能和过程的细胞功能试剂。 例如，MitoTracker 染料在活细胞的活性线粒体中积累，并共价附着在线粒体上，以评估线粒体定位和丰度。 相比之下，TMRM 和 TMRE 是动态线粒体膜电位指示染料，它们会根据膜电位在线粒体内外流动。
图 3.监测活细胞中的活性线粒体。培养患者的成纤维细胞系，并用 MitoTracker Red （货号 M22426）、Image-iT DEAD Green 染料 （货号 I10291）、Hoechst（货号 R37165）进行活细胞染色， 并在 Incucyte® ZOOM 活细胞成像系统上检测和分析。（图像来源：Smith GA, Jansson J, Rocha EM, Osborn T, Hllett PJ, Isacson O. Fibroblast Biomarkers of Sporadic Parkinson's Disease and LRRK2 Kinase Inhibition.Mol Neurobiol.2016 Oct;53(8):5161-77.PMCID: PMC5012155.）用 MitoTracker Red 染色的细胞如图所示，线粒体活跃的细胞呈鲜红色，死亡细胞呈绿色，细胞核呈蓝色，并用 Incucyte® ZOOM 活细胞分析仪进行成像。
M7514,A66441,M22426,A66440,M7512,A66443
图像视频案例
活细胞成像视频图集精选
HeLa 活细胞采用 Tubulin Tracker Deep Red 和 NucBlue Live ReadyProbes 试剂进行标记，分别用于检测活细胞中的微管细胞骨架和细胞核。采用共聚焦显微成像系统采集高分辨率图像。
与过表达荧光融合蛋白标记相比，采用 Invitrogen Tubulin Tracker Green 染料和 Invitrogen MitoTracker Red CMXRos 染料标记 HeLa 细胞具有更加出色的多色标记兼容能力且染色更均匀。细胞在含钙和镁的、添加了1X Probenecid 溶液的 Gibco HBSS 缓冲液中成像。采用带有 Olympus 20X Super Apochromat 物镜的 EVOS FL Auto 2 成像系统，使用 GFP 和 Texas Red EVOS 光立方生成图像。
HeLa 细胞使用 NucBlue Live ReadyProbes 试剂、Tubulin Tracker Green 染料和 Invitrogen LysoTracker Deep Red 染料进行标记，呈现出优异的多色标记兼容能力和非常好的染色特异性。细胞在含钙和镁的、添加了1X Probenecid 溶液的 Gibco HBSS 缓冲液中成像。采用带有 Olympus 60X Super Apochromat 油镜的 EVOS FL Auto 2 成像系统，使用 DAPI、GFP 和 Cy5 EVOS 光立方生成图像。
U2OS 细胞用 Invitrogen LysoTracker Blue DND22 染料、Invitrogen MitoTracker Green FM 染料和 Tubulin Tracker Deep Red 染料标记，显示出极好的多色标记兼容能力和染色特异性。细胞在含钙和镁的、添加了1X Probenecid 溶液的 Gibco HBSS 缓冲液中成像。采用带有 Olympus 60X Super Apochromat 油镜的 EVOS FL Auto 2 成像系统，使用 DAPI、GFP 和 Cy5 EVOS 光立方生成图像。
HeLa 细胞使用 NucBlue Live ReadyProbes 试剂、Tubulin Tracker Green 和 CellLight Mitochondria-RFP 进行标记，呈现出很好的多色标记兼容能力和染色特异性。细胞在含钙和镁的、添加了1X Probenecid 溶液的 Gibco HBSS 缓冲液中成像。采用带有 Olympus 60X Super Apochromat 油镜的 EVOS FL Auto 2 成像系统，使用 DAPI、GFP 和 RFP EVOS 光立方生成图像。
与过表达的荧光融合蛋白标记相比，使用 NucBlue Live ReadyProbes 试剂、ER-Tracker Green 和 Tubulin Tracker Deep Red标记的 HeLa 细胞具有更加出色的多色标记兼容能力且染色更均匀。细胞在含钙和镁的、添加了1X Probenecid 溶液的 Gibco HBSS 缓冲液中成像。采用带有 Olympus 20X Super Apochromat 物镜的 EVOS FL Auto 2 成像系统，使用 DAPI、GFP 和 Cy5 EVOS 光立方生成图像。
U2OS 细胞用 NucBlue Live ReadyProbes 试剂、CellLight 肌动蛋白-GFP、CellLight 线粒体-RFP 和 Tubulin Tracker Deep Red标记，显示出极好的多色标记兼容能力和染色特异性。细胞在含钙和镁的、添加了1X Probenecid 溶液的 Gibco HBSS 缓冲液中成像。采用
EVOS FL Auto 2 成像系统，搭配 Olympus 60X Super Apochromat 油镜，使用DAPI、GFP、RFP 和 Cy5 EVOS 光立方生成图像。
用 CellLight Mitochondria-RFP 和 CellLight Golgi-RFP 转导 HeLa 细胞（在含 10％ FBS 的 MEM 中生长）。24 小时后，用 NucBlue Live ReadyProbes 试剂对细胞核进行复染。使用 60X Apo 物镜和 DAPI、GFP 和 RFP LED 光立方在 EVOS FL Auto 2 成像系统上捕获图像。
COS7 活细胞的四重图像。微管蛋白用 Invitrogen Tubulin Tracker Green 染料标记、线粒体用 Invitrogen MitoTracker Orange 染料标记、细胞膜用 Invitrogen CellMask Deep Red 染料标记、核用 Hoechst 33342 试剂染成蓝色。使用结构光照明显微镜 (SIM) Zeiss ELYRA S.1 拍摄图像。图像由 Biocenter University Wuerzburg 的 M. Sauer 和 L. Behringer-Pließ 提供给赛默飞世尔科技。
U2OS 活细胞的四色图像。微管蛋白用 Tubulin Tracker Green 染料标记、线粒体用 MitoTracker Orange 染料标记、细胞膜用 CellMask Deep Red 染料标记、细胞核用 Hoechst 33342 试剂染成蓝色。使用结构光照明显微镜 (SIM) ELYRA S.1 拍摄图像。图像由 Biocenter University Wuerzburg 的 M. Sauer 和 L. Behringer-Pließ 提供给赛默飞世尔科技。
用 Invitrogen CellLight Mitochondria-RFP red 染料和CellLight Talin-GFP green 染料转导 HeLa 细胞 24 小时，然后用 Invitrogen NucBlue Live ReadyProbes Reagent-Hoechst 33342 标记 15 分钟。为了抑制光漂白，将细胞与 Invitrogen ProLong Live 抗淬灭试剂孵育 90 分钟，然后在 Invitrogen EVOS 细胞成像系统上成像。
COS7 活细胞的三色图像。微管蛋白用 Tubulin Tracker Green 染料标记、细胞膜用 CellMask Orange 染料标记、细胞核用 Hoechst 33342 试剂染成蓝色。使用结构光照明显微镜 (SIM) ELYRA S.1 拍摄图像。图像由 Biocenter University Wuerzburg 的 M. Sauer 和 L. Behringer-Pließ 提供给赛默飞世尔科技。
用 CellLight Mitochondria-RFP red 染料和 CellLight Talin-GFP green 染料转导 HeLa 细胞 24 小时，然后用 NucBlue Live ReadyProbes 试剂-Hoechst 33342 标记 15 分钟。为了抑制光漂白，将细胞与 ProLong Live 抗淬灭试剂孵育 90 分钟，然后在 EVOS 细胞成像系统上成像。
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用 50 mM 甲萘醌处理的 U2OS 细胞。四甲基罗丹明，甲酯，高氯酸盐 (TMRM)（货号 T668）线粒体电位指示剂，并随着氧化应激而褪色，如 CellROX Green 试剂（货号 C10444）所示。
用 Tubulin Tracker Deep Red（货号 T34076）标记的海马神经元。
用 CellLight Tubulin-GFP（货号 C10613）、CellLight Actin-RFP（货号 C10583）转染的 U2OS 细胞。
技术资源合集
在线技术讲座干货：活细胞成像实验流程 5 步法
欲了解更多信息和数据，请参阅以下海报：
海报：用于活细胞显微镜检查中半胱天冬酶活化和线粒体超氧化物的新一代传感器海报：使用酶标仪对 2D 和 3D 细胞模型进行细胞健康状况评估海报：使用荧光显微镜和高内涵成像技术对活细胞和固定细胞进行低氧测量海报：通过荧光表征评估细胞衰老
*Incucyte® Live-Cell Analysis System 是 Essen BioScience 的商标或注册商标。除非另有说明，Incucyte、Essen BioScience 及所有 Essen BioScience 产品名称均为 Essen BioScience 的注册商标和财产。Essen BioScience 是 Sartorius 的子公司。MuviCyte™ live-cell imaging system 是 PerkinElmer 的商标或注册商标。THUNDER Imager Live Cell & 3D Assay 和 MICA Microhub 显微镜由 Leica Microsystems CMS GmbH 销售。